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聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎的临床价

摘要 目的：探讨聚合酶链反应(PCR)在新型隐球菌脑膜脑炎快速诊断的临床价值，方法：应用聚合酶链反应检测50例临床脑脊液标本中的新型隐球菌，同时用直接涂片墨汁复染、真菌培养进行对比检测。结果：在50例患者临床脑脊液标本中，PCR检测11例阳性，阳性率：22.0%;直接涂片墨汁复染7例阳性，阳性率14.0%;真菌培养9例阳性，阳性率18.0％。结论：对新型隐球菌脑膜炎的实验室诊断，直接涂片墨汁复染方法简便易行，但阳性率较低；真菌培养需时间较长，达不到快速诊断的目的，使许多病人失去抢救机会；聚合酶链反应作为一种新的分子生物学方法，可从病原体的基因内部探测存在与否，具有快速、特异、敏感的特点，对新型隐球菌脑膜脑炎的快速诊断具有重要的临床意义

关键词：新型隐球菌；脑膜脑炎；聚合酶链反应；墨汁复染；真菌培养

The clinic value of polymerase chain reaction in diagnosing cryptococcus neoformans meningoencephalitis

Key Word: cryptococcus neoformans；meningoencephalitis；polymerase chain reaction；Chinese ink smear；fungal culture
【Abstract】　Objective　To evaluate the clinic value of polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of cryptococcus neoformans meningoencephalitis. Methods　PCR 、Chinese ink smear and fungal culture were respectively used in the detection of cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid of 50 case of patients. Results　In cerebrospinal fluid of 50 case , PCR detection in 11 case were positive (22%), Chinese ink smear detection in 7 case were positive(14%), and cryptococcus neoformans could be detected by fungal culture in 9 case (18%). Conclusion　As a new method of molecular biology ,The PCR detection could be used in quickly diagnosing cryptococcus neoformans meningoencephalitis from cerebrospinal fluid. This PCR-based detection and identification provides a rapid laboratory method for the diagnosis of cryptococcus neoformans meningoencephalitis and shows its potential for clinical applications.

0 引言
隐球菌病是一种由新型隐球菌所引起的人兽共患性疾病，各种哺乳动物均可为该菌的常见宿主，其在人类感染中有嗜中枢神经系统的倾向。近年来由于抗生素和肾上腺皮质类固醇的广泛应用，新型隐球菌性脑膜脑炎的发病率呈逐年升高的趋势。目前对该病的诊断主要依据脑脊液直接涂片墨汁复染及真菌培养两种方法，但由于前者阳性率较低，而后者所需时间较长，使得许多患者失去抢救的机会。自80年代中期兴起的聚合酶链反应(PCR)诊断技术，由于具有操作简便、准确率高的特点，为快速诊断新型隐球菌脑膜炎提供了可能。本研究中，我们以新型隐球菌全基因序列选择高度特异的保守区基因为引物，采用PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌，并将结果与使用直接涂片墨汁复染、真菌培养和和结合临床诊断隐球菌性脑膜脑炎的方法进行比较，以探讨PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌在临床诊断隐球菌性脑膜脑炎中的价值和意义。

1 材料和方法
1.1 材料 标本来源：50例脑脊液标本，来自西京医院神经内科住院及门诊就诊的患者。新型隐球菌特异性引物序列的设计与合成[1]：根据goldkeY数据库中新型隐球菌全基因序列分析，选取URA保守序列,扩增片段为：426bp，由上海生工生化工程公司合成。Taq DNA酶、4xdNTP购自华美生物工程公司；墨汁为优质印度墨汁；沙氏真菌培养基为西京医院检验科细菌室制备。
1.2 方法
1.2.1脑脊液标本模板DNA的提取：取脑脊液200 ul，12000r/min离心5min,弃上清，沉淀中加碱性裂解液(2mMol/LNaOH,0.1%吐温－20，0.1%TeetwoX100，0.1%NP-40)98℃10min,12000r/min离心5min，取上清做模板。
1.2.2 PCR扩增：反应总体积为25ul,包括10×PCR缓冲液2.5ul,4×dNTP 1.5ul,引物1.2各0.25ul,无菌去离子水9.5ul,模板10ul,Taq DNA聚合酶1U/ul,以无菌石蜡油30ul覆盖,进入PCR循环,循环参数为:95℃5min,94℃1min,58℃1min,72℃1min,32个循环,最后72℃延伸5min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶(含E电泳100V 30min,紫外灯下观察结果,出现特异性条带者为阳性。
1.2.3 直接涂片墨汁复染：将脑脊液12000r/min离心5min,弃上清，取沉淀制片，滴加墨汁复染3～5min,显微镜观察。
1.2.4 真菌培养：取脑脊液于沙氏肉汤中37℃24h增菌培养，转种于血液琼脂平板上37℃培养24h，待菌落生长后，然后进行涂片、生化鉴定。

2 结果
2.1 临床标本的检测：应用PCR技术、直接涂片墨汁复染、真菌培养，对50例脑脊液标本同时检测，其结果见表1

表1 三种方法对50例脑脊液检测结果分析
检测方法 例数 阳性数 阴性数 阳性率(%)
PCR技术 50 11 39 22.0

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作者:admin@医学,生命科学    2011-04-07 17:17
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