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孕妇外周血中分离胎儿细胞及临床运用
1 孕妇外周血中胎儿细胞的发生机理和种类
早在1893年，Schmol等提出死于子痫的孕妇肺循环中存在胚胎的滋养叶细胞[2]。到了1969年Walknowska等在22例怀男胎的孕妇外周血中发现有19例存在46，XY核型的细胞，并认为这些细胞是经胎盘进入母体的胎儿细胞[3]。随后的大量报道也证实了这一观点。我国学者朱静等通过形态学观察结合原位杂交技术证实了胎儿细胞能穿越胎盘屏障进入母体外周血[4]，为开展无创性产前基因诊断提供了实验证据。
目前认为在孕妇外周血中的胎儿细胞大致有四种：滋养细胞、白细胞及淋巴细胞、干细胞及造血干细胞、有核红细胞。
滋养细胞 滋养细胞尽管是最早出现在母血中的胎儿细胞，但它在母血中很快被母亲的肺组织所消除。同时大约1％的滋养细胞呈多核特征及嵌和核型[5]；无特异性单克隆抗体等阻碍了其在产前诊断中的运用。
胎儿淋巴细胞 虽有从母体中分离胎儿淋巴细胞并进行产前诊断的报告，但因其在母血中长期存在，既往孕程所遗留的淋巴细胞会干扰本次诊断。使得他不能运用于实际。
干细胞及造血干细胞 Lo等从母血中分离出红系造血母细胞[6]；Valerio等也成功地分离出造血母细胞[7]。近年来也从母血中分离出了间叶干细胞等[8]。由于干细胞在体外培养时具有自我更新、复制和分化能力，一度被认为是一种比较好的诊断材料。但也正是其数量少、更新能力强，在母血中停留时间长而限制了它咱临床上的运用。
经过多年的研究和比较，人们把期望的目光集中到胎儿有核红细胞（FNRBC）上。FNRBC有其较短的生命周期,在母血中存活大约90d，不受既往孕程的干扰[9]。属于单核细胞，含有全套的遗传信息。同时在其表面有多种特异性抗原如CD71、CD36、GPA等，能有效地从孕妇外周血中分离出来。同时在数量上相对较多。这些众多的优点使它成为研究的热点。
2 有核红细胞的富集
有核红细胞在母血中含量极少，有研究表明，每105－107个有核细胞中才有1个胎儿有核红细胞[10]。因此有必要对它进行富集以提高浓度便于后续的诊断。常用的分离方法有离心法、电荷流分离法、流式细胞仪法、磁性细胞分离法、免疫磁珠法等。
离心法 离心法是利用细胞的大小、密度、沉降系数的不同将目的细胞分离出来。常用二倍梯度法及不连续三倍密梯度法。Bhat等利用不连续三倍密梯度法使FNRBC得到25倍的富集[11]。Ganshirt等用离心法在孕程中后期成功地分离出了FNRBC[12]。现富集胎儿细胞一般先通过离心法进行初步的浓缩，然后结合其他的方法再进一步富集。
电荷流分离法 有核红细胞由于表面多糖中的硅酸分子成分使得其表面带有一定的负电荷密度[13]。根据不同细胞带有的表面电荷密度不同以及在离子梯度中的泳动速度不同从而使FNRBC分离出来。此方法富集的FNRBC产量极高。用此法分离的有核红细胞30％为胎源性的[14]。
流式细胞仪法（FACS） 该方法早于20年前就用于胎儿细胞分离的研究。利用测定流动的细胞悬液中单个细胞所散射光及结合特定单抗后所发散的荧光等多种参数，由细胞分选器分离出FNRBC。
磁性细胞分离法（MACS） 利用结合了磁珠的单抗标记FNRBC，在磁场的作用下将它分选出来。此方法操作简单、费用低，与FACS相比它的特异性高但效率相对较低[15]。Busch用双选法（先用CD45单抗负选，除去母源性的白细胞，再用DC71单抗筛选FNRBC），在20ml母血中分离出800个有核红细胞[16]。
FACS和MACS都是利用细胞表面特异性的抗原的不同来达到分选细胞的目的。但至今尚未发现任一只有FNRBC才特有的表面抗原[17]，故常运用多种表面抗原进行综合筛选。常用的有核红细胞表面抗原有：转铁蛋白受体（CD71）、血型糖蛋白A（GPA）、血栓敏感素受体（CD36）以及CD35、CD47。而用于负选去除白细胞的有CD45、CD14。Bianchi在1990年首先用抗CD71，经流式细胞分离仪成功分离了FNRBC。他也对CD71、CD36、GPA分离效率进行比较研究，其准确率分别为：CD71(57%)、CD36(88%)、CD36/CD71与GPA联用都为100％[18]。但Lewis发现用GPA是易引起凝集反应[19]，干扰了FNRBC的分离。今年来也有用细胞内抗原来分离细胞。Bianchi采用Kleihauer－Betke技术对HbF进行染色也分离到了FNRBC[20]。现也有用胸苷激酶为标识进行细胞分离的报道。由于胎儿细胞表达高水平的胸苷激酶，而正常成人血细胞几乎不表达。Makas利用它为标识物成功地分离到胎儿细胞[21]。
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作者:admin@医学,生命科学 2011-02-28 17:12
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