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辣根过氧化物酶神经束路追踪技术
TMB法
1971年Kristenson等及1972年Lavail等先后将辣根过氧化物酶（HRP，从辣根中提取的一组同功酶的混合物）用于追踪周围神经及中枢神经系统的纤维联系，此法的问世，大大推动了神经解剖学的发展。它是基于神经元轴浆运输的生理现象，即将HRP注射至中枢神经系统或周围神经的一定部位，HRP可被神经末梢以胞饮的方式摄入，逆行运送至胞体，经过一定时间后取相应的部位固定、切片，然后用组织化学方法显示HRP的标记。
一、TMB法实验原理
神经组织的冰冻切片在含H2O2的TMB溶液中孵育，组织内之HRP与H2O2结合成[HRP-H2O2]络合物，此络合物可氧化供氢的TMB，使之形成深兰色沉淀物，沉积在HRP周围。
二、主要仪器
1．恒冷箱切片机
2．20℃恒温水浴箱
3．光学显微镜
三、主要试剂及其配制
1．HRP（Sigma）
2．固定液（2%多聚甲醛，1.25%戊二醛缓冲液）
多聚甲醛 10 g
双蒸水 225 ml
加温60℃，滴加10N NaOH使之溶解，冷却。
0.2M磷酸缓冲液（pH7.4） 250 ml
置4℃冰箱冷藏，临用时加冷的（4℃）25%戊二醛 25 ml
3．生理盐水
4．20%蔗糖缓冲液
蔗糖 100 g
0.1M磷酸缓冲液(pH7.4) 500 ml
5．0.2M醋酸缓冲液（pH3.3）
A液：醋酸钠 13.6 g
双蒸水 100 ml
B液：浓盐酸 7 ml
双蒸水 92 ml
A、B两液混合后，用36%醋酸调pH至3.3，4℃冰箱贮藏备用
6．预孵育液
A液：亚硝基铁氰化钠（硝普钠） 22.5 mg
双蒸水 23.13 ml
0.2M醋酸缓冲液（pH3.3） 1.25 ml
B液：四甲基联苯胺（TMB） 1.25 mg
无水乙醇 0.63 ml
37℃静置5 min
临用时溶解，A、B液混合。
四、操作步骤
1．动物（大鼠）腹腔注射10%水合氯醛（0.6 ml/200 g）麻醉，固定于手术台上。
2．经一定部位（如脊神经节、坐骨神经断端、外周运动终板等）注射30%HRP生理盐水0.5μl，注射3～4点，缝合。
3．动物存活48 h。
4．动物麻醉同前，开胸，经左心室-主动脉插管，灌注温的（37℃）生理盐水冲洗血液至液体清亮，约200 ml。
5．灌注冷的（4℃）固定液500 ml。
6．灌注10%蔗糖缓冲液200 ml。
7．取材（如脊髓等），置于20%蔗糖缓冲液内4℃冰箱过夜。
8．标本以磷酸缓冲液略洗后，干冰迅冻或直接置恒冷箱内冷冻，切片30μm，贴于明胶载片上。回至室温凉干。
9．切片以0.01M醋酸缓冲液洗涤3次，每次10 min。
10．入20℃预孵育液，在避光条件下，恒温孵育20 min。
11．于预孵育液内加入30%H2O216.2μl，继续显色20 min。
12．切片用0.01M醋酸缓冲液冲洗5 min×3次。
13．入0.5%中性红溶液复染30 min后，以0.01M醋酸缓冲液充分冲洗干净。
14．各级酒精快速脱水，二甲苯透明、封片。
15．光镜下观察结果，HRP染色呈深兰色或兰黑色颗粒，沉积在胞浆内，此即HRP标记细胞。
五、注意事项
1．HRP运输到预定部位的时间取决于传送速度及距离。传送速度因动物的种类及纤维系统而有不同，故每组实验必须具体试验以求最佳动物存活期，一般2～3天比较合适。而时间过长，HRP可被胞体内的溶酶体逐渐破坏水解。
2．固定液必须新鲜，特别是戊二醛必须在临灌注时加入，一次用完。
3．孵育液配制过程中必须避光，因硝普钠见光照后易变色，变混。
4．孵育时需保持恒温20℃条件，温度过低易产生大量的针状沉淀而影响结果观察，温度过高不利于成色反应而容易出现假阴性结果。
5．切片漂洗过程中必须用pH3.3的醋酸缓冲液漂洗，过高的pH值可使之很快褪色。
6．TMB作呈色剂虽较DAB敏感，但不如DAB者稳定，易于扩散消失，故应尽快观察结果。
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作者:admin@医学,生命科学 2010-10-12 17:11
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