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绵羊卵母细胞的成熟与孤雌激活
摘 要 本文探讨了不同激素含量对绵羊卵母细胞成熟的影响以及不同激活条件刺激绵羊卵母细胞后卵裂及发育的影响。结果表明成熟液中添加10ug/ml FSH和0.9IU/ml LH成熟率最高（以卵丘细胞扩展和第一极体排出为准）；Ionomycin 与6-DMAP联合和A-23187与CHX联合都能激活绵羊卵母细胞；而电激活与化学激活结合可以更好的激活绵羊卵母细胞。
关键词：绵羊 卵母细胞 孤雌激活
体外受精技术是胚胎工程的重要组成部分，而卵母细胞的体外成熟是体外受精技术的关键步骤，卵母细胞的成熟情况是决定卵裂率及囊胚发育率高低的关键。激素是卵母细胞体外成熟所必需的，在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加促黄体素（LH）、促卵泡素（FSH）及雌激素能够促进卵母细胞的成熟并且有利于随后的体外受精和胚胎的体外培养[1]。在成熟培养液中添加LH 、FSH有利于绵羊卵母细胞的体外成熟，但添加剂量对其成熟率有很大影响。
研究哺乳动物卵母细胞的孤雌激活及体外发育，有助于探索卵母细胞的生理反应和了解哺乳动物早期胚胎的发育机理。经孤雌激活产生的单倍体和纯合体细胞在遗传育种上有着重要的意义。此外，核移植胚胎的起始发育，依赖于卵母细胞的有效激活。卵母细胞激活的方法较多，如乙醇处理、温度和渗透压的改变、机械刺激、钙离子载体A23187处理、细胞松弛素D或B、透明质酸酶处理、氯化锶处理、电刺激和蛋白质合成抑制剂处理等。由于所用方法及培养条件和动物种类不同，结果出入很大[2]。在绵羊核移植研究中，用体内成熟卵母细胞作核受体，虽然已成功地获得了代，但效率并不理想，用体外成熟卵母细胞作为核受体，可以大大的提高效率,这与卵母细胞体外成熟及激活条件有关[3]。众所周知，由于获得家畜体内成熟卵母细胞存在较大困难，所以利用体外成熟的卵母细胞作为核移植受体克隆动物，是使核移植技术具有实际应用价值的有效途径之一。但对绵羊卵母细胞体外成熟及激活的研究报道并不多。本研究中我们对绵羊卵母细胞体外成熟及激活条件进行了探索。
1 材料与方法
1.1 卵母细胞的收集
收集屠宰绵羊卵巢，保存于30℃的生理盐水中4h运回实验室尽快抽卵。
1.2 卵母细胞的体外成熟
从卵巢表面2~6mm卵泡内吸取卵丘卵母细胞复合物（COC）放入平衡好的成熟培养液中进行体外成熟。成熟培养液为TCM-199添加10%FBS，1ug/ml雌二醇。此外添加FSH（5ug/ml，10ug/ml，15ug/ml），LH（0.3IU，0.6IU，0.9IU）做3×3实验，每组实验重复三次，所用药品均购自Sigma公司。
1.3 卵母细胞的孤雌激活
在经过20~24h的体外成熟后，将COC放入0.5%透明质酸酶中，用玻璃针将卵丘细胞吹打干净，体视镜下检出有极体的卵母细胞，将卵母细胞分为三组：（1）Io+6-DMAP：用0.5µmol/L离子霉素处理4min，洗净，然后放入1.9mmol/L的6-DMAP（6-二甲基氨基嘌呤）中培养4h，转入SOF培养液中进行体外培养。（2）A23187+CHX：用5µmol/L的钙离子载体A-23187处理5min，洗净，放入10ug/ml环己酰胺中培养4h，转入SOF培养液中进行体外培养。（3）E：用1.2kv/cm的直流电压（融合时间30µs，脉冲次数为3）在融合室对卵母细胞进行孤雌激活（BTX-200型电融合仪），将激活的卵母细胞分别用1） E+Io+6-DMAP， 2）E+A23187+CHX激活，或3）直接进入SOF培养液中进行体外培养。每隔两天半量换液，观察卵裂率及囊胚率。每组实验重复3次。
1.4 数据处理
所有数据用卡方统计分析，P〈0.05 认为差异显著。
2 结果与讨论
2.1 不同激素含量对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。
我们以卵丘细胞扩展和第一极体排出作为卵母细胞成熟标志。由表1可以看出，当FSH5~10ug/ml时可以促进卵丘细胞扩展和第一极体排出，但当FSH浓度升高至15ug/ml，卵丘细胞不扩展或只有部分扩展。低浓度LH（0.3IU/ml）卵母细胞成熟率较低，
表1不同浓度FSH，LH对绵羊卵母细胞体外成熟的影响
卵丘细胞扩展情况 成熟卵数 出现第一极体卵数 成熟率（%）
A1(FSH5ug/ml;LH0.3IU/ml) +++ 78 48 61.5a
A2(FSH5ug/ml;LH0.6IU/ml) ++++ 78 60 76.9b
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作者:admin@医学,生命科学 2010-12-28 05:14
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