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鼠源单克隆抗体人源化进展
1．恒定区人源化--鼠/人嵌合抗体（chimeric antibody）
由于异源性Ab的免疫反应约有90%是针对恒定区（C区），要降低mAb的抗原性，必须 对Ab的恒定区进行人源化[1]。其原理使从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞，通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。这种嵌合抗体同鼠源抗体比较至少有以下两个优点：首先，它可以按需要对抗体的效应基因进行选择或剪切。例如人Ig的同种型IgG1和IgG3对介导补体依赖及细胞介导的溶解作用具备优势，因而利用该技术可以拼接不同亚类的人C区基因，来改变抗体的效应功能，使原细胞毒性较低的IgG2a和IgG2b变成细胞毒性较高的IgG1和IgG3，增强抗体的免疫治疗功能，可用来杀死肿瘤细胞。其次，在治疗中使用人而不是鼠mAb的同种型，大大减小了鼠源mAb作为异种蛋白对人体的免疫原性，它通过避免抗同种型抗体的产生，减少了HAMA的生成。例如，当鼠对鼠Ig互补决定区（CDR）产生免疫耐受时，用鼠抗-淋巴细胞Ab可以激发抗独特型反应，但相对那些对可变区不耐受的动物来说，该鼠的抗独特型反应被推迟并很微弱[2]。Lobulio对鼠/人嵌合抗体在人体内的动力学和免疫反应的研究表明，鼠/人嵌合抗体在人体内的半衰期比mAb长6倍以上。他用由鼠17-1AmAb可变区及人IgG-1K恒定区构成的鼠/人嵌合抗体用于10名转移性结肠癌患者，除一名患者在用药的63天和84天有轻微抗体反应外，其余患者均未发生毒性反应或过敏反应。并且唯一的抗体反应能被鼠17-1AmAb抑制，表明该抗体反应是针对嵌合抗体中鼠可变区的[3]。由于异源性抗体的免疫反应约有10%是针对V区，在嵌合抗体里，抗-V区反应并不减弱，这表明外来VH框架部分完全能够诱导强烈的抗-抗体反应。这种异源抗-V区反应的程度与用免疫鼠的Ighb抗体同种型的Igha抗体引起的同种异型反应类似。因此，尽管嵌合抗体可以消减抗-抗体反应，但V区的免疫原性和多态性也是值得注意的[1]。骆训懿等采用RT-PCR技术，将鼠抗人TNF-a抗体克隆后筛选出功能性VH、VL基因，并将该轻链、重链基因分别克隆到鼠/人嵌合轻链、重链表达载体中，构建鼠源性更低的抗人TNF-a鼠/人嵌合抗体，来抑制炎症介质TNF-a引起的病理反应[4]。迄今已研制出很多鼠/人嵌合抗体，有些已陆续进入临床应用，主要用于恶性肿瘤的诊疗，它在预防移植排斥反应也取得了较为满意的效果，在治疗自身免疫疾病以及控制药物过量、药物过敏反应中已显示出巨大优势。
2.可变区人源化—CDR移植Ab（CDR grafting antibody）
由于鼠/人嵌合抗体保留了鼠可变区，仍引起HAMA，因此有必要将可变区也人源化。其原理是将鼠源mAb的6个互补决定区的氨基酸序列插入到人Ig的框架区，通常称为CDR移植。CDR移植技术的理论依据是：⑴CDR是决定抗原结合位点的唯一结构，因而也是抗体特异性和亲和力的决定部位。⑵框架区能够接受外源CDR的植入[5]。CDR移植不仅可以降低mAb的免疫原性，而且还可以把鼠源mAb与Ag结合的性质授予人抗体。CDR移植抗体中非人序列含量低（约5%），研究已证实其免疫原性大大减小，并且在人体内的血清半衰期延长[6，7]。然而，只通过移植CDR序列产生的人化抗体与抗原结合的能力远不及其亲代鼠源Mab[8，9]。总结27个有亲和力测定数据的CDR移植抗体，63%的亲和力有10%-81%的降低[10]，有的亲和力下降了至少有几百倍[11，12]。为了恢复其高亲和力，必须对mAb进行进一步的分析、设计、改建工作，使其抗原决定环的结构更加完善。Chothia和LesK首先提出一些框架残基对CDR构象因此的重要性，并综合地检测了所有影响抗原结合的框架残基[13]。Xiang等发现嵌合抗体B72.3的71和93框架残基是重链超变环构象的主要决定部分[14]。因此，可用亲代鼠源抗体的相关序列替代CDR移植抗体V区框架区的关键残基，使CDR构象得以维持。但这同时又增加了鼠源序列的成分，致使免疫原性也加强。从治疗的角度考虑，最好是能够找到框架区变化最小而抗原亲和力有很高的人化抗体。尽管有分子模拟法的指导，但要测定哪些框架变化对抗原结合有益，通常需要分析许多不同的抗体突变型。为了简化抗体人源化进程，通常的方法是选择与鼠源单抗同源程度较高的人框架区作框架，这可使人化抗体框架区与亲代鼠源框架区的残基错配数达到最小值，制备除CDR序列外结构几乎相同的治疗抗体。如常以NEWM[8，15]。作为移植抗体的VH框架，REI[8]作为 VL框架。通常改变个别氨基酸残基的组成以保证抗体的亲和力。然而，值得注意的是一个错配的框架残基就可能对抗原的结合产生巨大影响。1988年，Richmanne等CDR移植抗体（hVHL·CAMP-TH-1·IgG1）的某个位点上的氨基酸通过点突变（Ser27®Phe，Ser30®Thr）进行“微调”，显著增强了该抗体的亲和力[7]。Padlan建立了另一个人源化方法：不是将鼠源CDR移植到人框架区，而是将完整的鼠V区保留并选择需要被人序列代替的框架残基。但当抗体被主要阻止相容性复合物分子II降解时，其中隐藏的鼠源框架区残基能激发T细胞免疫反应。所以，以此法研制出的鼠源mAb（22，23）是否有免疫原性，仍需进一步检测[16]。目前，对CDR移植的人源化路线是，在鼠/人嵌合抗体的基础上，通过数据库检索、计算机分子模拟等寻找出有最大同源性的人可变区模板，综合考虑表面残基、与CDR有相互作用或对空间结构有重要影响的残基，确定需要保留和改变的关键残基，再通过模拟基因合成，表达检测实际效果，进行必要的修正，来获得高亲和力的治疗mAb。目前已构建出多种针对不同抗原的CDR移植抗体，有些已应用于临床诊治，并取得了令人满意的效果，如消除肿瘤，延长器官移植生存期，改善类风湿关节炎、全身性脉管炎、感染性疾病及免疫混乱性疾病的临床症状等。
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作者:admin@医学,生命科学 2011-04-15 17:11
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