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rpoB基因在结核分支杆菌感染及利福平耐药中的应
目的 初步总结rpoB基因检测在结核分支杆菌（Mtb）感染及利福平（RFP）耐药分析中的应用。
方法 以人型复合分支杆菌特异的rpoB基因为靶基因的套式PCR（nested PCR,nPCR）扩增痰、胸水、外周血标本中的Mtb rpoB；并对23株RFP耐药的rpoB nPCR产物进行了直接DNA序列测定。
结果 1、54例痰标本35例阳性（64.8%）；2、23株RFP耐药菌均存在有义突变。其中密码子513位由CAA→AAA1例,516位由GAC→GTC、GAC →TAC各1例；526位由CAC →CGC4例、CAC→GAC,CAC→TAC各1例；531位由TCG→TTG13例,TCG→TGG1例。
结论 对患者临床标本进行rpoB nPCR扩增有望辅助诊断结核病，对rpoB nPCR产物直接DNA测序有望判别耐RFP与否。这将大大缩短结核病诊断和药敏试验所需时间。
[关键词] 结核分支杆菌 利福平耐药 诊断
结核分支杆菌利福平的耐药性检测普遍采用改良的罗氏培养法和BECEC 法加药敏试验，但由于培养基不同，检测方法不同，判定标准不一，国内目前尚缺乏有说服力的统一标准。况且由于药敏试验是建立在培养基础上的，因此培养阴性的结核病患者根本无法做药敏试验。近年来，国内外学者不断报告较传统 PCR更为灵敏、特异的套式 PCR（nested PCR,nPCR）技术诊断结核病阳性检出率明显高于罗氏培养、BECTEC 培养和传统 PCR。
为此，我们以结核分支杆菌 rpoB基因为靶基因建立rpoB 套式PCR 技术。通过对套式 PCR产物直接测序，根据细菌基因型判别结核分支杆菌对利福平的敏感性，以探讨序列分析辅助诊断的可能性。并藉以了解常州地区耐利福结核分支杆菌的基因突变情况。
对象与方法
一、 对象
56例浸润性肺结核病人均为2001年3月至10月来我院结核科就诊者。年龄18-77岁，平均49.9 15岁。其中男性49例，女性7例。主要临床表现为低热、盗汗、咳嗽、部分病人伴咯血，胸痛。
二、 方法
1.痰标本收集：留取清晨咳痰标本3-5ml于有盖密闭灭菌管中，如咳痰量太少时，可收集当日晚至次日清晨咳出的全部痰液。
—2.痰标本预处理：碱处理法。痰液中加1N NaOH 2-4倍量，振荡器振荡5-10分钟或置室温30分钟，其间振荡2-3次，使痰液化。
3.Bactec培养：为BACTEC 480仪，按标准操作程序进行。
4.rpoB nPCR：以Mtb rpoB基因为靶基因的nPCR试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。为人型复合分支杆菌群特异，灵敏度可达一个Mtb菌。具体操作步骤详见文献[1]。
5.rpoB nPCR产物直接DNA测序：将纯化的nPCR产物、测序引物（无锡市克隆遗传技术研究所提供）、荧光标记试剂（美国PE公司提供）混合，按94℃ 25秒→55℃ 15秒→64℃ 4分钟→,循环25周期进行末端终止法循环测序.测序反应产物在美国ABI 310型测序仪上读序.
结果
56例浸润性肺结核痰Bactec培养、套式PCR检测结果见表1。
表1.56例浸润性肺结核四种方法检测Mtb结果
Mtb检测方法 例数 阳性例数 阳性率（%）
Bactec培养 47 18 38.3
套式PCR 56 32 57.1
图1 rpoB nPCR电泳图
三、 23株RFP耐药菌经rpoB nPCR和产物直接DNA测序均存在有义突变，详见表2。
表2 .40株RFP耐药菌测序突变状况
密码子宊变位点 碱基置换 氨基酸置换 株数
511 CTG→CCG Leu→Pro 1
513 CAA→AAA Gln→Arg 1
CAA→CTA Gln→Leu 1
516 GAC→GTC Asp→Val 2
GAC→TAC Asp→Tyr 2
GAC→AAC Asp→Asn 1
526 CAC→CGC His→Arg 4
CAC→TAC His→Tyr 2
CAC→GAC His→Asp 1
531 TCG→TTG Ser→Leu 21
TCG→TGG Ser→Trp 1
TCG→TAT Ser→Tyr 1
533 CTG→CCG Leu→Pro 1
无特变 3
讨论
结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题，估计目前全世界每年有800万新病例发生，290万人死于结核病，是当今单一致病菌致死的最主要死因。近十几年来结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，产生原因之一是耐药菌株的产生和播散。1990年我国结核病流行调查结果表明，我国临床分离株耐药率达39.9％，初始耐药率31.7％，复治继发耐药率47.8％。利福平是一种主要的抗结核药物，对利福平耐药常常导致化疗失败，且被认为是多耐药菌株的标志之一。
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作者:admin@医学,生命科学 2010-12-01 05:11
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