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嵌合抗CD20Fab’抗体片段诱导Raji 细胞的凋亡机制
摘要 目的 探讨嵌合抗CD20抗体Fab’片段的抗肿瘤机制。 方法 应用MTT法检测Fab’片段对Raji细胞生长的抑制作用，用Annexin V-FITC和PI测定Fab’片段对Raji细胞凋亡的诱导作用，用RT-PCR和Western blot检测Raji细胞中bcl-2表达的变化。 结果 嵌合抗CD20Fab’片段对Raji细胞具有明显的抑制作用IC50值为24.2 µg/ml，并呈剂量依赖性；嵌合抗CD20Fab’片段能诱导Raji细胞的凋亡，并降低Raji细胞中bcl-2基因及其蛋白的表达水平。 结论 嵌合抗CD20抗体片段Fab’能抑制Raji细胞生长和诱导细胞凋亡，其作用机制与bcl-2蛋白表达的下降有关。
关键词：抗CD20抗体；B淋巴瘤；Bcl-2
中文分类号: R318; R733
CD20对B淋巴细胞的分化增殖具有调节作用[ 1 ]。CD20是治疗B淋巴细胞瘤的理想靶点。CD20在前B细胞及成熟B细胞中有表达，而浆细胞、造血干细胞及T细胞则无CD20的表达；CD20比较暴露不为其它表面分子所掩盖，易与抗体结合；CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少；在人体血清中无游离的CD20存在；最重要的是B淋巴细胞瘤上的CD20少有内吞和脱落的发生[ 2-5 ]。1997年，以CD20为靶点的嵌合抗CD20单克隆抗体Rituxan已获准应用于B细胞淋巴瘤的治疗[ 6 ]。HI47(IgG3)是我所于1990年研制成功的国内第一个抗CD20鼠源性单克窿抗体，第四届国际人类白细胞分化抗原会议将HI47命名为CD20+X[ 7 ]。我们利用噬菌体显示技术从HI47杂交瘤细胞中克隆到抗CD20抗体HI47可变区基因，将该基因构建成为嵌合的抗CD20抗体Fab’片段，并在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达[ 8 ]，本研究的目的在于研究嵌合抗CD20Fab’片段的抗肿瘤活性及其作用机制。
1材料和方法
1.1材料
MTT购自Sigma公司；Annexin-V为宝灵曼公司试剂盒；TRIZOL RNA提取试剂盒为美国Gibco公司产品；兔抗人bcl-2单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为北京中山生物技术有限公司产品，嵌合抗CD20Fab’片段为我室表达并纯化。β-actin引物（上游：5-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3,下游：5-GTCTTT GCGGATGTCCACG-3）和bcl-2引物（上游：5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3,下游：5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTT
*基金项目：国家高技术研究发展专项经费资助（中试基金国科生字2000141和20001AA215341）；天津重大基金(003119511)资助项目
作者简介：范冬梅（1969-）女（汉族）籍贯 天津 中级职称 研究方向 基因工程抗体的研究工作
CC-3）均由上海生工公司合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及实验分组
人B淋巴瘤细胞株Raji细胞为我室所存，细胞生长于RPMI1640培养基中，含15%灭活小牛血清，37℃，5%，CO2潮湿环境中培养。将处于对数生长期的Raji细胞稀释成5ⅹ105/ml,加入嵌合抗CD20Fab’片段至一定浓度，继续培养一定时间后，进行各种指标测定。
1.2.2 MTT法测定肿瘤细胞生长抑制作用
将处于对数生长期的Raji细胞稀释并按每孔2ⅹ104个细胞接种于96孔细胞培养板中，然后加入不同浓度的Fab’片段溶液，每组3个孔，置37℃，5%CO2环境中培养72 h。实验终止前4h每孔加入新鲜配置的MTT 磷酸缓冲液20 µl，继续培养4 h后将96孔板离心，弃掉上清，每孔加入DMSO 200 µl，然后振荡摇匀，于酶标仪测定各孔吸光度值。
1.2.3 Annexin-V染色试剂盒检测细胞凋亡
采用宝灵曼试剂盒，按照说明书操作进行。
1.2.4 RT-PCR分析bcl-2基因的表达
按照TRIZOL RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，RT-PCR试剂盒进行逆转录和PCR扩增反应。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察并拍照，β-actin为内参照。
1.2.5 Western blots 测定细胞bcl-2蛋白的表达
Raji细胞经细胞裂解液裂解后，经Folin-酚法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度至等量上样,经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉4℃ 封闭过夜,室温下与兔抗人bcl-2单克隆抗体反应1.5 h，辣根过氧化物酶标记的二抗反应1.5 h，充分洗膜，用发光试剂盒显色并拍照。
2. 结果
2.1 MTT法测定结果
为了检验嵌合抗CD20Fab’片段对 Raji细胞,的生长抑制作用,以PBS为阴性对照，用MTT法测定Fab’片段对 Raji细胞生长的影响，其结果显示，Fab’片段对Raji细胞具有抑制作用,其抑制作用具有明显的剂量依赖性,其半数抑制量为(24.2±7.8) µg/ml。
表1嵌合抗体CD20 Fab’片段对Raji细胞的生长抑制率
Tab 1 The inhibition rate of Raji cells by the anti-CD20 chimeric fragment Fab’
Fab’（µg/ml） Inhibition rate（%）
6.25 31.0±5.6
12.5 37.0±5.3
25 42.7±8.0
50 57.7±8.5
100 71.2±10.8
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作者:admin@医学,生命科学 2011-03-10 05:12
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