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我的综述：重组活载体疫苗研究进展
1 重组活载体疫苗的研究历史
自1982年Machett等人采用牛痘病毒为载体成功表达了外来抗原以来（Mackett M等，1982），重组活载体疫苗的研究得到了长足发展。Panicali D 1982年将单纯疱疹病毒的胸苷激酶（Thymidine Kinase，TK）基因通过共转染真核细胞培养物进行体内同源重组的方法构建了重组痘苗病毒（Panicali D等，1982）。此后，以痘苗病毒为载体的重组狂犬病疫苗在西欧一些国家得到广泛使用。1990年表达F基因的重组鸡痘病毒在美国注册；1994年美国批准允许生产表达新城疫病毒的HN和F蛋白基因的重组疫苗，成为第一个商业活载体疫苗（Mcmillen J等，1994）；1995年美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗Vector VAXFP-N的商品化。还有许多其它重组载体疫苗已在实验室阶段证明有效。初步的研究结果已显示出用重组活载体疫苗作疫苗具有广阔的应用前景，有望发展成为一种经济有效的新型疫苗。
2 重组活载体疫苗的基本原理
重组活载体疫苗的基本原理是利用基因操作技术将病原的保护性抗原基因插入另一种载体微生物基因组或染色体外DNA（质粒）的某些部位使之复制目的基因，并表达重组蛋白，但不影响该载体病毒（或细菌）的生存与繁殖，且能诱导机体的体液免疫和细胞免疫。接种这种重组疫苗以后，不仅能对原病毒（或细菌）产生保护力，还获得对插入基因相关疾病的保护力（殷震等，1997）。
3 重组载体疫苗的筛选与鉴定方法研究进展
重组载体疫苗的研究，是一项复杂的系统工程，所涉及的环节众多，工作量大。制备重组载体疫苗的基本过程包括目的基因的制备、基因载体的选择、基因重组、基因重组体的转化、重组体的筛选与鉴定、外源基因的表达等步骤。其中从转化的细胞中筛选出含重组体的细胞，并鉴定重组体的正确性是制备重组活载体疫苗的重点与难点，也是开发重组疫苗工作中迫切需要解决的问题。据报道，鸡痘病毒与重组转移质粒在CEF细胞内同源重组的机率很低，仅为0.01%（Spehner D等，1990；Boursnell ME 等，1990；Parks RJ等，1994）。因此努力提高重组机率或探索高效筛选手段对重组活载体疫苗的研究具有重要意义。对于不同的重组活载体疫苗，选用有效的方法，则能迅速、准确地筛选与鉴定出重组体。不同载体系统、不同宿主系统其重组体的筛选方法不尽相同。常用的载体有质粒、噬菌体和病毒。目前重组载体疫苗主要依据重组体的表型、目的基因或目的基因产物等进行筛选与鉴定。现将该有关技术的基本原理及其应用概况予以综述，以期为重组载体疫苗的筛选与鉴定提供理论依据。
3.1 根据重组体的表型进行筛选
根据重组体的表型筛选也叫遗传检测法。所谓表型（Phenotype）是指生物体遗传组成与环境相互作用所产生的外观或其他特征。表型特征来自两方面，一是由载体提供，一是由插入外源DNA提供。
3.1.1 利用载体提供的表型筛选
分子克隆载体携带的遗传标志包括抗药性标志、营养标志、报道基因（Reporter gene）等。
抗生素（Antibiotic）是一类生物体产生的用来抑制或杀死另一类生物的物质。抗生素抗性（Antibiotic resistance）是生物对某种抗生素的耐受性，其机制包括使抗生素失活、减少细胞摄入或增加排出抗生素、改变其靶蛋白，以及产生另一些酶或代谢途径等。利用基因插入失活（Insertional inactivation）是常用的筛选方法；当抗生素性基因前有一类调控序列时，可用插入该序列外源片断进行插入表达筛选。此法多用于以质粒为载体的重组疫苗的筛选与鉴定。常用来做为标志的有氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因及大肠杆菌的lac基因等。
β‐半乳糖苷酶显色反应是另一类常用的筛选标志。β‐半乳糖苷酶由lac Z基因编码。一些载体中含有lac启动子，lac操纵基因及lac Z基因的59个密码子区段，即α‐肽。该载体与宿主细胞编码的N‐末端缺陷的β‐半乳糖苷酶多肽发生基因内互补，在含有X‐gal和诱导物IPTG培养基中把X‐gal切割成半乳糖和深蓝色的5′‐溴‐4‐氯‐锭蓝，菌落为蓝色，而α‐序列中插入外源DNA者菌落呈白色，故又称蓝白斑法（马章亮等，1998）。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒中鉴定重组子的工作。仅仅通过目测就可以轻而易举地从数千个菌落中挑选出可能带有重组质粒的菌落。但是并非所有白色菌落均带有重组质粒，最后还必须通过限制性酶切分析，才能确定带有重组质粒的菌落。李萍等利用含有X‐gal和中性红的营养琼脂培养基，通过蓝白斑法挑选出表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK（李 萍等，1999）。
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作者:admin@医学,生命科学 2011-03-15 05:11
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