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TMEFF2同源基因的原核表达
【摘要】 目的 GST-TMEFF2融合蛋白的诱导表达和纯化 方法 带有TMEFF2蛋白基因的质粒通过亚克隆的方法扩增,将TMEFF2蛋白基因转移到pGEX-4T-1后转化入E.colBL21,经IPTG诱导表达后,通过超声破碎、化学洗脱等方法纯化融合蛋白,以SDS-PAGE进行鉴定. 结果? 结论?
【关键词】TMEFF2 亚克隆 GST融合蛋白 ?
?
Expression of TMEFF2 homologen in the mouse central nervous system
Abstract: Objective to obtain GST-TMEFF2 fusion protein(or The induced expression and purification of GST-TMEFF2 fusion protein) Methods the TMEFF2 gene was subcloned into expression vectors pGEX-4T-1,and transformed into E.coliBL21.After the IPTG-induced expression,the target GST-TMEFF2 fusion protein was purified by sonication,chemical eluting,and use SDS-PAGE to precise. Results the target GST-TMEFF2 fusion protein was detected after IPTGinduction and purified protein were obtained by affinity chromatogrophy with GST agarose column. Conclusion the 60bp-sized target TMEFF2 protein was obtein after expression and putification.
Key words: TMEFF2;subclone;fusion protein,GST.
TMEFF2蛋白(EGF样的跨膜蛋白),被证实为大鼠大脑海马回处,据信与神经营养有关.为了研究TMEFF2蛋白在大脑中枢神经退化性病变中起到的遏制作用,将GST-TMEFF2融合蛋白通过亚克隆获取目的基因,然后利用IPTG诱导表达,后纯化最终获取该蛋白,以备后用.
材料和方法
1.材料
1.1 ?菌株为BL21 携带有TMEFF2蛋白基因的质粒? 表达载体OGEX-4T-1,氨苄青霉素抗性(+).
1.2 试剂:Qlaprep Miniprep 、IPTP为Sigma公司产品；质粒纯化试剂盒为上海赛百威基因技术有限公司产品；限制性内切酶EcolⅠ、SalⅠ为？；T4噬菌体DNA连接酶为？；FSB PBST LB/Amp+培养基? GST亲和柱
1.3 仪器: 超声波裂解仪? 摇床? 离心机? 水浴? rocking plate SDS-PAGE电泳仪?
2.方法
2.1 亚克隆
2.1.1 克隆载体的转化扩增与纯化:克隆载体与100ul感受态大肠杆菌混合,冰浴15min后在42℃热休克90s,加入800ul SOC?复苏,在37℃下摇床45min后,取100ul菌液于LB/Amp+固体培养基过夜培养,挑取孤立菌落于5mlLB/Amp+培养液过夜培养. 取?ul菌液按Sigma公司的Qlaprep Miniprep试剂盒纯化质粒.
2.1.2 TMEFF2-GST的获得:取克隆载体与表达载体PGEX各?ul分别加入1.5ulEcolⅠ 1.5ulSalⅠ?酶切?h,根据凝胶电泳结果取大小约为800Bp的TMEFF2目的基因和40KB条带的已酶切表达载体于离心管,加入?ulT4噬菌体DNA连接酶在37℃下连接?h.
2.1.3 表达载体pGEX的转化扩增与纯化:表达载体与100ul感受态大肠杆菌混合,冰浴30min后在42℃热休克90s,加入800ul SOC复苏,在37℃下摇床45min后,取100ul菌液于LB/Amp(+)固体培养基过夜培养,挑取孤立菌落于5mlLB/Amp(+)培养液过夜培养. 取?ul菌液按上海赛百威基因技术有限公司的质粒纯化试剂盒纯化质粒.
2.2 GST-TMEFF2融合蛋白基因的诱导表达与纯化
2.2.1 诱导表达:将纯化的PGEX按2.1.3的方法转化入E.colBL21,过夜培养,挑取孤立菌落接种到5ml/Amp+培养液过夜培养. 次日取100ul菌液接种到5mlLB/Amp(+)培养液37℃下培养4h.用250ulIPTG(5mMol)诱导GST-TMEFF2融合蛋白表达,37℃下摇床培养2h.
2.2.2 纯化:4℃下3500rpm 离心 10min后去掉上请液加750ulPBST,超声裂解细菌,收集20ul菌液.剩余菌液4℃下3500rpm离心 10min,取上清液4℃下14000rpm高速离心5min.取290ul上清液并用GST亲和柱纯化.4℃下14000rpm离心1min后去掉上清液用0.5ml的PBST洗脱两次,加入50ul2×FSB煮沸5min.
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳:SDS-PAGE采用不连续垂直板状电泳,分离胶浓度为15%,积层胶浓度为5%.
3.结果
4.讨论
5.参考文献 4.讨论
5.参考文献
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作者:admin@医学,生命科学 2011-02-23 17:11
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