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以端粒为靶的反义核酸技术治疗肿瘤
端粒酶是由小分子ＲＮＡ和蛋白质组成的一种特殊核糖核蛋白逆转录酶。端粒酶在肿瘤的发生、发展过程中起着非常重要的作用。迄今发现，人体绝大多数肿瘤 (近 90 % )有端粒酶的活化表达[2]。端粒酶被认为是一种广泛的肿瘤标志，端粒酶活化参与细胞的癌变过程已得到肯定。端粒酶通过延长端粒而维持肿瘤细胞的持续增殖能力。许多细胞通过端粒酶的表达下调或酶裂解而退出细胞周期。在正常生长条件下，抑制端粒酶活性，肿瘤来源的细胞将继续分裂并伴随着端粒的缩短，最终处于静息状态或死亡。
反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新的技术。1978年，Zamecnik首先应用一种1 3个碱基的寡核苷酸抑制 Rous肉瘤病毒，取得一定效果，此后，随着对其作用机制、特异性及药理作用等研究的深入，其应用范围不断扩大。由于该技术其核苷酸具有与DNA意义链相同的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。广义的反义核酸技术包括：1.反义寡核苷酸技术 (antisense oligonucleotide, ASOD)，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸，通过碱基配对与细胞内核酸结合，特异的调节基因表达。2.反义RNA技术(antisense RNA)，是利用基因重组技术，构建表达载体，使其离体或在体内表达出反义的RNA。3.核酶技术(ribozyme)核酶是一种可自我催化的特殊的反义RNA，能与靶序列结合并使之裂解，从而对特定基因的表达进行调控。目前，在基因功能的研究和基因治疗中，人们越来越广泛的应用反义核酸技术来抑制目的基因的表达，该技术在分子生物学和药物化学中有着巨大的发展潜力[3]。
一般认为反义寡核苷酸是通过直接阻断翻译而起作用，其作用的位置在胞质。早先，大多数研究以5‘翻译区或mRNA启动一编码重叠区为靶位点。然而，最近的证据提示小脱氧寡核苷酸具有明显的进入细胞核的能力。因此．核内mRNA前身物(hnRNA)剪接供点也可作为设计反义寡核苷酸的靶位点。寡核苷酸抑制基因表达的机制主要是抑制翻译作用[3, 4]。在无细胞翻译系统中，反义寡核苷酸与mRNA启动位点结合后形成RNA—DNA杂交链，使RNaseH活性增加，将杂交链中的RNA部分降解掉，从而破坏翻译的启动。在爪蟾受精卵中，也已证明反义寡核苷酸能通过RNa盟H介导使靶mRNA降解。但是在非受精卵中似无上述作用，所以在体内，反义寡核苷酸是否通过RNaseH介导而起翻译抑制作用尚需证实。
1 以端粒结合蛋白为靶点
端粒结构由端粒重复序列和端粒结合蛋白组成。ＴＲＦ(ｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｐｅａｔｂｉｎｄｉｎｇｆａｃｔｏｒ)包括ＴＲＦ1和ＴＲＦ2两类，前者调节端粒长度，后者维持端粒的完整。现已分别构建了缺乏功能区的ＴＲＦ1和ＴＲＦ2的腺病毒表达载体，其表达产物具有抑制ＴＲＦ1和ＴＲＦ2的作用。转染肿瘤细胞后，ＴＲＦ1及ＴＲＦ2的抑制蛋白同时表达，则可减少ＴＲＦ1的产量，并引起细胞迅速凋亡[5]。提示端粒不完整或缩短可不通过衰老途径而直接引发凋亡信号。因此，抑制ＴＲＦ在今后的肿瘤治疗中可能有较大潜力。
2 以端粒酶ＲＮＡ(ｈＴＲ)为靶点
(1 )ｈＴＲ模板区突变 :端粒酶以其ＲＮＡ为模板合成端粒 ,设想将其模板区突变 ,则可获得突变的端粒ＤＮＡ。人ｈＴＲ模板区含 1 1个核苷酸 (5′ -ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ - 3′),将其突变为ＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣ或ＣＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣ，并重组入质粒Ｐｇｒｎ3 3 ,转化Ｈｅｌａ细胞，可出现相应的端粒和细胞表型改变[5 ]。端粒酶模板区ＴＬＣ1(ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔ1)基因突变或缺失细胞株的端粒进行性缩短 ,呈衰老表型 ,但ＴＬＣ1和ＥＳＴ1 (ｅｖｅｒ ｓｈｏｒｔｅｒ ｔｅｌｏｍｅｒｅ)基因联合突变并不比单个基因突变引起的衰老表型强。提示端粒的异常使其易受核酸酶的攻击，引
起染色体异常或脱失，从而导致细胞衰老或死亡。
(2 )ｈＴＲ模板区封闭: 由于只有与模板区ＲＮＡ及其周围序列互补的反义寡核苷酸 (ＡＳＯＤＮ)才具有端粒酶活性的抑制作用，因此封闭ｈＴＲ模板区为其基因治疗的一个重要方向。Ｆｅｎｇ等[4]从肾细胞克隆出的ｈＴＲ中设计出可结合并灭活端粒酶的反义ＲＮＡ链 ,并将其转染Ｈｅｌａ细胞 ,可观察到肿瘤细胞分裂增殖 2 3～ 2 6个周期后其端粒酶活性减低，ＴＲＦ缩短 ,细胞增长受抑，最后死亡。近期已有反义ｈＴＲ作用于肿瘤细胞的体内外实验，结果令人鼓舞。Ｋｏｇａ等[6]根据ｈＴＲ设计合成反义寡核苷酸，再与 2-5Ａ分子连接形成 2 - 5Ａ反义ｈＴＲ，作用于 7株膀胱癌细胞 (ＵＭ-ＵＣ-2 ,ＵＭ-ＵＣ-3 ,ＵＭ-ＵＣ– 6，ＵＭ-ＵＣ- 9,ＵＭ-ＵＣ- 1 4，ＲＴ4和Ｔ2 4)。发现4ｄ内其端粒酶活性即下降到 2 1 %～ 55% ,具有明显的抗膀胱癌细胞作用，而正常的成纤维细胞ＷＩ3 8因无端粒酶活性表达 ,对其作用无影响。进一步的动物实验表明，2 - 5Ａ反义ｈＴＲ可通过诱导凋亡，显著抑制裸鼠皮下ＵＭ-ＵＣ-2肿瘤的生长。在所有反义ｈＴＲ中，以Ｎｏｒｔｏｎ等[7]设计的以Ｎ-(2-氨乙基 )-甘氨酸为肽骨架结构单位的ＰＮＡｓ(ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ)最具潜力 ,因其具有与天然ＤＮＡ分子相似的结构特征和结合特性，与靶基因形成二聚体或三螺旋结构 ,合成简易 ,化学稳定性高 ,不易被核酸酶和蛋白酶降解 ,已证实其对人端粒酶活性的抑制具有较强的序列特异性和高度选择性及时间与剂量依存性 ,是一种值得开发的抗肿瘤反义药物。国外已有ＡＳＯＤＮ直接作用于急性或慢性白血病靶基因的报道 ,互补于ｃ-ｍｙｃｍＲＮＡ的ＡＳＯＤＮ可抑制ｂｃｒ/ａｂｌ依耐性慢性粒细胞白血病 (ＣＭＬ)患者的白血病细胞增殖[8];
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作者:admin@医学,生命科学 2010-10-20 20:10
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