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微型双功能抗体抗CD3/抗Pgp的构建和表达(核心期刊

摘要 目的 构建和表达抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体，并测定该微型双功能抗体的生物学活性。 方法 采用PCR和overlap PCR方法构建抗CD3/抗CD20微型双功能抗体，并用双脱氧终止法测定DNA序列；采用亲和层析法纯化该产物，并用Western blot和分子排阻层析鉴定纯化产物；采用免疫荧光法、放射免疫分析法和玫瑰花环试验鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性。 结果 DNA序列测定结果表明：抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体已构建成功，表达可溶性产物的产量达2mg/l以上，纯化产物中二聚体的比例达90%，具有与Jurkat（CD3+）和K562/A02细胞（Pgp+）结合的活性，与抗CD3ScFv及抗PgpScFv的亲合常数相当且能同时与Jurkat和K562/A02细胞结合形成玫瑰花环。结论 首次成功地构建了抗CD3/抗Pgp微型双功能抗体，并获得高效表达，表达产物具有与相应二个靶抗原结合的活性，
关键词 单克隆抗体，CD3，Pgp，基因工程抗体，双功能抗体

中国图书分类号 Q786

应用针对特异肿瘤抗原的单克隆抗体对肿瘤进行治疗是肿瘤免疫疗法的重要组成部分。与传统化疗相比，单抗具有针对性强的特点，因此避免了对正常组织的杀伤，特别对于清除肿瘤的残留灶、转移灶具有良好应用前景。
单抗应用于肿瘤的治疗主要有两方面的困难：首先具有恒定区的大分子量单抗具有较长的半衰期且能介导ＣＤＣ及ＡＤＣＣ作用但且很难穿透肿瘤发挥杀伤作用。而缺失恒定区的小型基因工程抗体虽然具有较好的穿透性，但半衰期短且本身细胞毒作用低。因此，抗体片段与放射性同位素、前药（prodrug）、生物毒素及免疫效应细胞形成偶联物成为治疗肿瘤特别是实体瘤的首选方案。其中最有临床应用前景的是利用双特异抗体使针对肿瘤抗原的单抗与效应细胞相连，共同作用于肿瘤细胞，实现肿瘤的靶向治疗。Diabody[1]是基因工程双功能抗体的一种形式。这类抗体片段通常是由一个启动子控制下的两个顺反子表达产物间反向配对而成具有两个抗原结合位点的双特异抗体片段。它的基本原理是同一顺反子中VH和VL因Linker太短（通常只有5-12个氨基酸），产生空间位阻，不能配对，只能与另一顺反子上的VH和VL配对，从而形成二聚体。通常使用的效应细胞主要有T细胞(CD2，CD3)、NK细胞(CD16)、单核/巨噬细胞（CD64）、树突状细胞（CD64）和激活的髓系细胞（CD64，CD89），由于存在以下三方面的原因，使得以T细胞为效应细胞要比其它两类细胞为效应细胞来构建双特异抗体更为常见：一.T细胞群中存在着免疫记忆细胞；二.有证据表明在恶性肿瘤患者体内存在着肿瘤特异性的T细胞 ；三.体内外实验表明抗CD3抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）比IL-2激活的杀伤细胞（LAK）具有更强大的细胞毒效应 [2[。体内外生物学实验结果表明：Diabody能同时与T细胞和癌细胞结合，并通过激活T细胞，来靶向杀灭癌细胞[3,4]。
HIT3a[5]和PHMA02[6]是我所研制的鼠源性抗CD3和抗Pgp（P-glycoprotein）单克隆抗体，我们在克隆单克隆抗体HIT3a和PHMA02轻、重链可变区基因的基础上，构建和表达了抗CD3/抗Pgp Diabody，并研究了其生物学功能。

1  材料与方法

1．1 材料
1．1．1 细胞系和载体：E.coli 16C9由本室保存。多药耐药细胞系K562/A02由本室建立[7]。Jurkat 和K562细胞系有本室保存,培养在含10%小牛血清（本所科技开发公司）的RPMI1640（GIBCOBRL）。抗CD3 ScFv表达载体[8]和抗Pgp ScFv表达载体本室构建。表达载体pYZF和克隆载体pYZL由我室保存。
1．1．2 酶和试剂：Tag DNA聚合酶，限制性内切酶mluI，nheI，sphI，notI均购自GIBCOBRL公司，抗CD3单克隆抗体HIT3a由本所协和科技公司提供，抗Pgp单克隆抗体PHMA02由本室制备。鼠抗E-tag抗体，HRP标记的鼠抗E-tag抗体及抗E-tag亲和层析柱均购自Pharmacia公司。FITC标记的羊抗鼠IgG多抗购自北京中山生物工程公司。其它均为国产分析纯生化试剂。
1．1．3 PCR引物
P1 5’ CTA GCG CAC GCG TAC GCT GAC ATC GAG CTC ACT CAG TCT CC 3’ (mluI)
P2 5’ CGA CCC TCC GCC ACC CCG TTT CAG CTC CAG CTT G 3’
P3 5’ GGT GGC GGA GGG TCG CAG GTC AAA CTG CAG CAG TC 3’
P4 5’ GAG CTA GCT AGC TCA TGA GGA GAC GGT GAC CGT G 3’ (nheI)
P5 5’ CGA CCC TCC GCC ACC CCG TTT ATA TTC CAG CTT GGT 3’
P6 5’ GGT GGC GGA GGG TCG CAG GTG CAG CTG CAG CAG T 3’
P7 5’ GAA TAT CGC ATG CGG TGG TCA TGA GGA GAC GGT GAC CGT G 3’ (sphI)
P8 5’ CTT CGA GCT AGC TAC CCG GGG ATC CTC TAG AG 3’ (nheI)
P9 5’ CGC ACC TGC GGC CGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG 3’ (notI)
下画线为括号内的限制性内切酶位点

1．2 方法
1．2．1 DNA的酶切、连接、转化等常规分子生物学操作按文献[9] 进行。

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作者:admin@医学,生命科学    2010-09-26 18:32
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