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我的研究论文:人血管内皮生长因子的克隆表达及
内容提要 目的：克隆表达人血管内皮生长因子165( vascular endothelial growth factor 165, VEGF165) 基因，制备VEGF免疫学检测工作标准品。方法：用RT-PCR从肝癌组织扩增目的基因VEGF165，插入到pUCm-T质粒中并测序鉴定。构建原核表达重组质粒pET32a-hVEGF165，转化入大肠杆菌，经IPTG诱导，固化Ni2+吸收色谱纯化得到重组人VEGF165（recombinant human VEGF165，rhVEGF165）。用Western Blot检测rhVEGF165免疫原性，并通过HUVEC增殖试验检测rhVEGF165生物学活性。按标准品的要求制备VEGF检测工作标准品，最后用ELASA 试剂盒标定。结果：PCR产物为600bp，测序结果表明其序列正确，人VEGF165可在大肠杆菌内可溶性表达，rhVEGF165蛋白相对分子质量为38kD，具有生物学活性。工作标准品浓度标定为5.05pmol/L。结论：成功地克隆了有生物学活性的VEGF165基因，并制备出VEGF免疫学检测工作标准品。
关键词：血管内皮生长因子；克隆；工作标准品
血管内皮生长因子能特异的、高效的促进血管内皮细胞有丝分裂，促进血管生成。血液或其他体液中VEGF含量的测定，对恶性肿瘤患者的疗效观察和预后判断具有参考价值。由于VEGF在体内含量甚微，无法用传统的纯化方法得到。本文用基因重组的方法在大肠杆菌内表达具有天然活性的人VEGF165，并制备了VEGF免疫学检测工作标准品，为下一步研究开发VEGF检测试剂盒奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料 RT-PCR 试剂盒购自Qiagen公司；EcoRⅠ 、NotⅠ和T4 DNA 连接酶以及pUCm-T载体购自上海生工公司；pET32a(+)及His Bind Resin色谱柱购自Novagen公司；兔抗人VEGF多克隆抗体购自Chemicon，USA； VEGF检测ELASA试剂盒和MTT 试剂盒购自R&D公司； HUVEC及BL21trxB(DE3)为本室保存。其他化学试剂皆为分析纯。
1．2 扩增hVEGF165全长基因序列 引物设计用Primer Express 软件进行，序列如下: 上游引物序列为5’-TAG AAT TCG CAC CCA TGG CAG AAG GAG G-3’,含限制性酶切位点EcoRⅠ，长28 bp , G+ C 含量53.57 %；下游引物序列为 5’–TAG CGG CCG CTA TCA CCG CCT CGG CTT GTC -3’, 含限制性酶切位点NotⅠ,长30 bp ,G+ C 含量66.67 %。引物由上海博亚公司合成。抽提肝癌组织总RNA作为模板，进行RT-PCR 反应，收约600bp 大小的目的片段后进行TA克隆，酶切鉴定得到重组T载体pUCm-T-hVEGF165，送检测序证实。
1. 3 重组原核表达载体pET32a-hVEGF165的构建 将含有hVEGF165全长cDNA 的pUCm-T-VEGF165质粒用EcoRI 和NotⅠ双酶切并胶回收约600bp片段；将pET32a(+)质粒用EcoR I 和NotⅠ双酶切并胶回收已线性化pET32a(+)。用T4 DNA 连接酶将两个回收片段连接、转化、扩增阳性菌落得到重组质粒，酶切鉴定无误后命名为pET32a-hVEGF165 。
1．4 蛋白诱导与纯化 带将构建好的重组质粒pET32a-hVEGF165，转化到大肠杆菌BL21trxB(DE3)，挑取单菌落在含Ampicillin（50μg/ml）和Kanamycin (15 µg/ml)LB培养液中25℃培养过夜。按1:100转接于LB培养液（抗性同上）中继续培养至OD600=0.5~1.0时，加IPTG（终浓度为1mM）诱导，8小时后收集菌体进行SDS-PAGE（12%分离胶）。可溶性带组氨酸标签的蛋白用His Bind Resin色谱柱纯化，操作按说明书进行。
1．5 VEGF165蛋白免疫学活性检测 用Western Blot按常规进行。兔抗人VEGF165多抗1:400稀释，二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，按1:1000稀释。充分洗膜后，加入发光底物显迹液，曝光显影。
1．6 生物学活性测定
HUVEC细胞株测定：将HUVEC用无血清RPMI1640培养基洗3次，用含50ml/L血清的RPMI1640培养基调整细胞数至4×104/L。将rhVEGF165用无血清RPMI1640培养基稀释至浓度为100μg/L，并在96孔板上倍比稀释，每孔50μL，于37℃ 50ml/L CO2条件下培养36小时，每孔加入MTT 20μL。培养5小时后，加入200 g/ L SDS 80μL裂解细胞，1小时后用酶标仪读取A570的值，并绘制曲线。与对照组的曲线相比较，观察rhVEGF165的生物学活性。
1．7 VEGF参照标准品制备和标定
按照标准品的制备要求[1 ]，取一定量的rhVEGF165用PBS(0. 02 mol/ L pH7. 2)作适当稀释，使其浓度在ELASA可测范围内，用移液器分装，0. 5 ml/ 安瓿，分装误差小于1 %，用ELASA试剂盒测定其浓度。操作按产品说明书进行，重复测定10次，结果用 ±SD表示，单位换算成摩尔浓度。标定好的工作标准品置-70℃保存。
2 结果
2．1 克隆VEGF165 的序列测定 用RT-PCR 的方法从人肝癌组织中钓取了VEGF165 的全长cDNA，包括编码信号肽的序列，全长约600 bp 。由于Taq DNA聚合酶能在PCR 产物的3’端加入非模板序列的A，这样的PCR产物可直接与带有T 突出端的TA 克隆连接，构建成TA重组质粒, 我们将这一重组质粒命名为pUCm-T-hVEGF165。经DNA 序列分析，该cDNA 序列与Genbank (LOCUS： AF486837) VEGF cDNA 序列完全一致，结果未列出。
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作者:admin@医学,生命科学 2011-02-18 17:11
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