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mRNA差异显示技术与肿瘤基因表达
深水澜
关键词：差异显示 肿瘤 基因表达
近年来，随着DNA重组技术的发展，已有数万个人类基因被克隆分析，要从如此众多的表达基因中找到引起细胞生理病理变化的基因并非易事。mRNA差异显示PCR技术（mRNA differential display PCR，DD-PCR）是一种快速而有效的克隆差异表达基因的方法，又称为差别显示反转录PCR（differential display reverse transcription PCR, DDRT-PCR）。1992年，Liang等[1]首次应用该技术对比人类乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因。多年来，随着此项技术的不断完善，在生物医学领域中得到了广泛的应用，为寻找新基因提供了捷径，特别是在病理生理过程中寻找肿瘤细胞特有基因中起了极其重要的作用。
一、 DDRT-PCR基本原理
肿瘤细胞和正常细胞的差别就在于其基因表达的差异。肿瘤细胞中表达强烈而正常细胞中表达减弱或不表达的基因为癌基因，反之则为抑癌基因。mRNA差异显示技术是基于RT-PCR的基本理论而建立的。真核细胞mRNA含有poly(A)末端，在poly(A)前面的第一位碱基有3种可能（G、C、A），第二位碱基有4种可能（G、C、T、A），这2个碱基共有12种组合。根据这一特点设计3’端引物为oligo-dT12MN(M、N分别代表A、C、G、T四种碱基的一种，其中M不能为T)，共有12种引物。T12MN作为锚定引物将mRNA反转录为cDNA，对反转录产物采用5’端的随机引物和3’端的T12MN引物以及含有放射性同位素标记的dATP进行PCR扩增反应，所得的PCR产物用测序胶电泳分离，放射自显影，从中找出差异条带（即差异表达的cDNA片段）。切下差异条带用相同引物进行第2次PCR扩增，产物经标记制成探针，通过Norther杂交来验证其在不同样本中的表达差异。将差异的cDNA片段制备克隆并进行核苷酸序列分析，将测出的基因序列与GeneBank中的序列作同源比较，即可知分离和克隆到的是已知基因还是未知基因。
二、DDRT-PCR技术路线
1．总RNA的提取：
总RNA的提取方法多种多样，目前常用的酸性异硫胍一步法[2]、Trizol法[3]和使用标准RNA分离试剂盒[3]。抽提的关键是尽量减少RNA酶的污染，为减少假阳性，相比较的样品在同一条件下应用同种方法同时抽提，抽提的总RNA在反转录前必需经过脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）充分消化[4]，可设立不加反转录酶的对照来检验DNA是否被去除。紫外分光光度仪测其纯度[5]，甲醛变性凝胶电泳测其完整性[5]，28sRNA、18sRNA正常含量比值为1.5-2.2：1，若比值小于1：1，说明总RNA明显降解，不能满足实验要求，RNA是否降解及降解的程度如何，是实验成功的关键。
2．引物设计的优化
最初认为需要12种锚定引物，即T12MN和至少20种不同的随机引物才能把细胞中的mRNA全部显示出来，但通过实验发现，起决定作用的是3’端最后一个碱基，而3’端的倒数第二个碱基可呈现兼并性。因此，第2代差异显示采用四种T12MN引物。第三代差异显示技术[6]是利用单碱基把引物锚定于poly（A）的起始端，同时在锚定引物和随机引物的5’端引入限制酶切位点，以便克隆差异表达的片段，而引物的延长使cDNA谱带的选择性及重现性都增强。
3．标记方法的选择：
以前多采用放射性同位素（35S或32P）检测法来进行差异条带的显示，这种方法虽敏感性强，但存在很多缺点，如费时费力、对人身体有害等，最重要的是，为从DNA测序胶上比较密集的条带中分离出差异条带来，实验者必需手拿X光胶片作为对照来切割凝胶上肉眼看不到的条带，盲目性很大。近几年来多采用非放射性同位素标记的方法，目前常用的有：⑴荧光标记法：该方法是基于荧光素用测序的原理，对DD-PCR略加改进而建立的一种快速、安全、可靠、敏感并且能同时检测大量样本的mRNA差异显示技方法。与同位素相比，实验时间缩短，且减少了污染，同时该方法加长了引物，可减少电泳条带的复杂性，有利于回收差异条带特异扩增。有人用荧光素标记随机引物来进行mRNA差异显示取得了较好的结果[7 ]。但荧光法也有缺点，如出带较少，仪器设备昂贵，难以推广，且不同实验室的引物缺乏统一性。⑵银染法：其灵敏度比EB染色高200倍，硝酸银等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链、双链DNA和RNA都染成黑色。具有简便、快速、高效等优点，最重要的是能直接在凝胶上观察比较差异条带，用肉眼可见的方法从凝胶上切下差异的条带，避免同位素曝光切带的盲目性，并可避免同位素的危害。陈瑞川等[8]用此方法来做的胃癌标本的差异显示，陈晓梨等[ 9]用此方法来做白血病的差异显示，都取得了较好的结果。⑶化学发光检测法：基于化学发光测序法已被广泛应用，已证明是一个与同位素一样敏感、可靠的测序方法[10]。Rajeevan等[11]在该方法的应用上获得了一定的经验。不过该方法不像银染法那样可以直接从凝胶上切除肉眼可观察到的条带，仍需用显影的膜作对照从凝胶上切取感兴趣的条带，所以还有一定的差异性，且转膜、发光检测等也较复杂。⑷地高辛标记法：和前几种方法基本类似，与发光法相比，最突出的优点是直接在尼龙膜上显示和再扩增差异条带。南清振等[12]成功的用此方法分离并克隆出大肠癌相关基因。综合比较上述几种方法的优缺点，银染法是目前最可取的一种标记方法。整个过程在2个工作日内便可以完成，不受预定同位素，自显影曝光时间的限制，且费用比其他方法都要低，无污染，不需特殊设备，操作简单灵敏度也相当高，宜推广。
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作者:admin@医学,生命科学 2011-03-04 01:27
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